液氮罐內體細胞的凍存和再生原理是什么？

　　一、基本原理 在不用一切標準下立即凍存體細胞時，體細胞內和外自然環境中的水都是產生冰晶，能造成體細胞內產生機械設備損害、電解質溶液上升、血漿滲透壓更改、脫干、PH更改、蛋白質轉性等，能造成體細胞身亡。如向細胞培養液添加保護膜，可讓冰度減少。

　　在遲緩的凍潔標準下，能使體細胞內水分在凍潔前顯出體細胞。存儲在-130℃下列的超低溫里能降低冰晶的產生。 體細胞再生時速率要快，使之快速根據體細胞容易損傷的-5～0℃，體細胞仍能生長發育，魅力損傷并不大。 現階段常見的保護膜為二甲亞砜(DMSO)和凡士林，他們對體細胞不含毒性，含量小，溶解性大，易透過體細胞。

　　二、操作流程 (一)凍存

　　1、消化吸收體細胞(同試驗二)，將體細胞懸浮液搜集至離心管中。

　　2、1000rpm抽濾10分鐘，棄上清液。

　　3、沉定加含維護液的塑造，記數，調節至5×106/ml上下。

　　4、將懸液分至凍銀行存管中，每管1ml。

　　5、將凍銀行存管口封嚴。如用安瓿瓶則火苗密封，密封一定要嚴，不然再生*易出現崩裂。

　　6、貼標簽，注明體細胞類型，凍存時間。凍銀行存管外拴一金屬材料吊物和一輕繩。

　　7、按以下次序減溫：室內溫度→4℃(20分鐘〕→電冰箱冷藏室(30分鐘)→低溫箱(-30℃1鐘頭)→汽態氮(30分鐘)→液態氮。 留意：實際操作時要當心，以防液態氮凍傷。液態氮定期維護，隨時隨地填補，絕對不可以蒸發整潔，一般30立升的液態氮可用1～1.5月。

　　(二)再生

　　1、提前準備一個茶缸或1000ml的燒毀，內窗2/3杯37℃的溫開水。

　　2、從液態氮中取下凍銀行存管、快速放置溫開水中并持續攪拌。使凍銀行存管中的凍存物在1分鐘以內溶化。 3、開啟凍銀行存管，將體細胞懸浮液吸進離心管中。

　　4、1000rpm抽濾10分鐘，棄去上清液。

　　5、沉定加10ml細胞培養液，吹打勻稱，再抽濾10分鐘，棄上清液。

　　6、加適度培養液后將體細胞遷移至塑造瓶中，37℃塑造，第二天觀查生長發育狀況。

　　三、實驗試劑和器械 器械：液氮罐、凍銀行存管(塑膠螺旋燈專用型凍銀行存管或安瓿瓶)、離心管、塑料吸管、離心脫水機等 實驗試劑：0.25%胰酶、培養液、含保護膜的培養液(即凍存液) 附：凍存液配置： 培養液添加凡士林或DSMO，使其終濃度值達5—20%。保護膜的類型和使用量視不一樣體細胞而不一樣。選好后4℃下儲存。